PCR标准的反应体系
编辑：谭晓青 来源： 日期：2023/2/17 9:30:34
参加PCR反应的物质为模板、引物、耐热DNA聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸和镁离子，其中关键步骤是最佳引物的设计。
1. 模板核酸
模板(靶基因或样品DNA)核酸的量与纯化程度PCR标准的反应体系是PCR成败与否的关键环节之一。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。DNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)降解RNA。
2. 引物
PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链作引物。每条引物链的浓度为0.1~1μmol或10-100pmol，以反应所需要的最低引物量的浓度为好。
3. DNA聚合酶
TaqDNA聚合酶基因全长2496个碱基，75~80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性和良好的热稳定性，温度过高(90℃以上)或过低(22℃)都可影响TaqDNA聚合酶的活性。目前，有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
4. 三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。在PCR反应中，PCR标准的反应体系dNTP应为50-200μmol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，浓度过低又会降低PCR产物的产量。
5. 镁离子浓度
Mg2+能与dNTP结合，Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为20μmol/L时，Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜，Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增：浓度过低，会降低taqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
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