1参数测量原理

流式**仪可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。测量是在测量区进行的，所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点。液流中央的单个**通过测量区时，受到激光照射会向立体角为2π的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与**的大小、形态、质膜和**内部结构密切相关，因为这些流式**仪工作原理生物学参数又和**对光线的反射、折射等光学特性有关。未遭受**损坏的**对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活**进行分析和分选。经过固定的和染色处理的**由于光学性质的改变，其散射光信号当然不同于活**。散射光不仅与作为散射中心的**的参数相关，还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关。

在流式**术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②侧向散射（SSC），又称90角散射。这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度。*般说来，前向角散射光的强度与**的大小有关，对同种**群体随着**截面积的增大而增大；对球形活**经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系；对于形状复杂具有取向性的**则可能差异很大，尤其需要注意。侧向散射光的测量主要用来获取有关**内部*细结构的颗粒性质的有关信息。侧向散射光虽然也与**的形状和大小有关，但它对**膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，也能对**质内较大颗粒给出灵敏反映。

在实际使用中，仪器**要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色**。光散射测量*有*的用途是从非均*的群体中鉴别出某些亚群。

荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色，**内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由**经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫***学等测量中，对于结合水平不*的荧光*体来说，如何提*信噪比是个关键。*般说来，**成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、**色素等）的含量越*，自发荧光越强；培养**中***/活**比例越*，自发荧光越强；**样品中所含亮**的比例越*，自发荧光越强。

减少自发荧光干扰、提*信噪比的主要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③**电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。

2样品分选原理

流式**仪的分选功能是由**分选器来完成的。总的过程是：由喷嘴射出的液柱被分割成*连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定**液滴充电，带电液滴携带**通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有**捕获管来进行分选的。

稳定的小液滴是由流动室上的压电晶体在几十KHz的电信号作用下发生振动而迫使液流均匀**而形成的。*般液滴间距约数*μm。实验经验公式f=v/4.5d给出形成稳定水滴的振荡信号频率。其中v是液流速度，d为喷孔直径。由此可知使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选*果。使分选的含**液滴在静电场中的偏转是由充电电路和偏转板共同完成的。充电电压*般选+150V，或-150V；偏转板间的电位差为数千伏。充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的，因此从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要*段延迟时间，*般为数十ms。*确测定延迟时间是决定分选质量的关键，仪器多**移位寄存器数字电路来产生延迟。可根据具体要求予以适当调整。

（50）数据处理原理：FCM的数据处理主要包括数据的显示和分析，*于对仪器给出的结果如何*释则随所要*决的具体问题而定。

2.1数据显示：FCM的数据显示方式包括单参数直方图、二维点图、二维等*图、假三维图和列表模式等。

直方图是*维数据用作*多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同*般X—Y平面描图仪给出的曲线。根据选择放大器类型不同，坐标可以是线性标度或对数标度，用“道数”来表示,实质上是所测的荧光或散射光的强度。坐标*般表示的是**的相对数。图10-2给出的是直方图形式。只能显示*个参数与**之间的关系是它的局限性。

二维点图能够显示两个*立参数与**相对数之间的关系。坐标和坐标分别为与**有关的两个*立参数，平面上每*个点表示同时具有相应坐标值的**存在（图10-3）。可以由二维点图得到两个*维直方图，但是由于兼并现象存在，二维点图的信息量要大于二个*维直方图的信息量。所谓兼并就是说多个**具有相同的二维坐标在图上只表现为*个点，这样对**点密集的地方就难于显示它的*细结构。

二维等*图类似于地图上的等*线表示法。它是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。等*图上每*条连续曲线上具有相同的**相对或**数，即“等*”。曲线层次越*所代表的**数愈多。*般层次所表示的**数间隔是相等的，因此等*线越密集则表示变*率越大，等*线越疏则表示变*平衡。图10-4给出了二维等*图的样式。

假三维图是利用计算机技术对二维等*图的*种视觉直观的表现方法。它把原二维图中的隐坐标—**数同时显现，但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察“山峰”和“谷地”的结构和细节　，这无疑是有助于对数据进行分析的。图10-5为假三维图的示意图。

列表模式其实只是多参数数据文件的*种计算机存贮方式，三个以上的参数数据显示是用多个直方图、二维图和假三维图来完成的。可用ListMode中的特殊技术，开窗或用游标调出相关部分再改变维数进行显示。例如，“*调二”就是在*维图上调出二维图来；“二调*”就是从二维图中调出*维图来。图10-6给出了从二维图等*图中调出相应窗口的直方图的示意图。

上面简要地介绍了几种数据显示形式，在实际应用中，可根据需要选择匹配，以便了*和获得尽可能多的有用信息。

2.2数据分析：数据分析的流式**仪工作原理方法总的可分为参数方法和非参数方法两大类。当被检测的生物学系统能够用某种数学模型技术时则多使用参数方法。数学模型可以是*个方程或方程组，方程的参数产生所需要的信息来自所测的数据。例如在测定老鼠*子的DNA含量时，可以获取**频数的尖锐波形分布。如果**正态分布函数来描述这些数据，则参数即为面积、平均值和标准偏差。方程的数据拟合则通常使用*小二乘法。而非参数分析法对测量得到的分布形状不需要做**假设，即**无设定参数分析法。分析程序可以很简单，只需要直观观测频数分布；也可能很复杂，要对两个或多个直方图逐道地进行比较。

逐点描图（或用手工，或用描图仪、计算机系统）是大家常用的数据分析的重要手段。我们常可以用来了*数据的特性、寻找那些不曾预料的特异征兆、选择统计分析的模型、显示*终结果等。事实上，不经过*对数据进行直观观察分析就决不应该对这批数据进行数值分析。从这*点来看，非参数分析是参数分析的基础。

逐道比较工作量较大，但用直观法很容易发现明显的差异，特别是对照组和测试组。考虑到FCM的可靠性，要注意到对每组测量，都要有对照组，对照组可以是空白对照组、阴性对照组、或零时刻对照组等，具体设置应根据整体实验要求而定。对照组和测试组的逐道比较往往可以减少许多不*要的误差和错误*释。顺便指出，进行比较时对曲线的总**数进行归**处理，甚*对两条曲线逐道相减而得到“差结果曲线”往往是适宜的。